铁皮石斛联苄类化学成分的研究（一） 始载于《神农本草经》

研究铁皮石斛乙酸乙酯部分中联苄类化学成分。铁皮运用大孔树脂、石斛MCI、联苄类化硅胶、学成凝胶(Sephadex LH-20)、研究ODS等柱色谱、铁皮制备薄层色谱及制备高效液相色谱等技术进行化合物的石斛分离纯化，根据1H-NMR、联苄类化13C-NMR、学成MS等波谱数据和理化性质鉴定化合物的研究结构。从铁皮石斛乙醇提取物的铁皮乙酸乙酯部位分离得到了15个联苄类化合物，分别鉴定为dendrocandin X(1)、石斛3,联苄类化4'-二羟基-4,5-二甲氧基联苄(2)、6''-de-O-methyldendrofindlaphenol A(3)、学成3,研究4-二羟基-4',5-二甲氧基联苄(4)、dendrosinen B(5)、3,4,4'-三羟基-5-甲氧基联苄(6)、3,3'-二羟基-4,5-二甲氧基联苄(7)、3,4'-二羟基-5-甲氧基联苄(8)、杓唇石斛素(9)、石斛酚(10)、4,4'-二羟基-3,5-二甲氧基联苄(11)、3,4',5-三羟基-3'-甲氧基联苄(12)、3-O-methylgigantol(13)、dendrocandin U(14)和dendrocandin N(15)。化合物1为新化合物，化合物2首次在石斛属中分离得到，化合物3~7首次在铁皮石斛中分离得到。

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为兰科石斛属珍稀名贵药用植物，始载于《神农本草经》，被列为上品，自1963年版《中国药典》以“耳环石斛”收载后，历经多版修订，一直为中药石斛的基原植物之一，并于2010年版《中国药典》以“铁皮石斛”单列收载。

铁皮石斛性味甘、微寒；归胃、肾经，具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳等药效，用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热、目暗不明等。现代药理学研究表明，铁皮石斛具有增强人体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血压、促进消化等多种药理活性。为深入研究铁皮石斛抗肿瘤活性的物质基础，本研究前期以体外抗肿瘤活性为药效学指标，对铁皮石斛茎乙醇提取物的不同提取部位进行活性跟踪，确定其乙酸乙酯部位的体外肿瘤细胞毒性最强，并从中分离得到了15个联苄类化合物，经波谱学鉴定为dendrocandin X(1)、3,4'-二羟基-4,5-二甲氧基联苄(2)、6''-de-O-methyldendrofindlaphenol A(3)、3,4-二羟基-4',5-二甲氧基联苄(4)、dendrosinen B(5)、3,4,4'-三羟基-5-甲氧基联苄(6)、3,3'-二羟基-4,5-二甲氧基联苄(7)、3,4'-二羟基-5-甲氧基联苄(8)、杓唇石斛素(9)、石斛酚(10)、4,4'-二羟基-3,5-二甲氧基联苄(11)、3,4',5-三羟基-3'-甲氧基联苄(12)、3-O-methylgigantol(13)、dendrocandin U(14)和dendrocandin N(15)。其中，化合物1为新化合物 (图1)，化合物2为首次在石斛属中分离得到，化合物3~7为首次在该植物中分离得到。

1 材料

Bruker AV-400型核磁共振光谱仪(德国Bruker公司)；HR-ESI-MS联用仪(美国Waters公司)；LC3000半制备型高效液相色谱仪(北京创新通恒)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)。

制备型色谱柱为Capcell Pak C18色谱柱(20 mm×250 mm, 5 µm，Shiseido)；柱色谱硅胶(200~300、300~400目，青岛海洋化工有限公司)；薄层色谱硅胶板(HSGF254，烟台江友硅胶开发有限公司)；Sephadex LH-20(GE-Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden)；大孔吸附树脂D101(国药集团化学试剂有限公司)；MCI(75~150 μm，Mitsubishi Chemical Corporation，Japan)；ODS(40~60 μm，Sepax Technologies Inc.，USA)；CD3OD、CDCl3、DMSO(Cambridge Isotope Laboratories，USA)；色谱纯乙腈、甲醇 (DIKMA，USA)；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲醇(工业纯、分析纯，国药集团上海化学试剂公司)。

铁皮石斛于2018年11月采自贵州省贵阳市，由上海中医药大学中药研究所徐红研究员鉴定为铁皮石斛D. officinale，凭证标本(No.2018011-1) 保存于上海中医药大学中药研究所。

2 提取与分离

铁皮石斛干燥茎25 kg，粉碎成粗粉，用95%乙醇渗漉提取3次，合并提取液，减压浓缩得到乙醇提取物浸膏约3.0 kg。将浸膏中残留的乙醇挥干，混悬于水中，再用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩后得到乙酸乙酯萃取部位1.2 kg。

将乙酸乙酯部分1.2 kg用大孔树脂柱色谱进行分离，依次用水、30%、50%、80%、90%乙醇进行梯度洗脱，每梯度洗脱3个柱体积，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，回收溶剂得洗脱部分Fr.A~Fr.E。Fr.B经MCI色谱柱，甲醇-水(10:90~80:20)梯度洗脱，合并洗脱液得到亚组分Fr.B1~Fr.B6。Fr.B6亚组分经反相ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及制备型HPLC纯化得到化合物1(4.5 mg)。

Fr.C经MCI色谱柱，甲醇-水(10:90~80:20)梯度洗脱，合并洗脱液得到亚组分Fr.C1~Fr.C6。Fr.C2亚组分经反相ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱以及制备型HPLC纯化得到化合物6(4.6 mg)，12(9.8 mg)，13(8.7 mg)。Fr.D经MCI色谱柱，甲醇-水(10:90~80:20)梯度洗脱，合并洗脱液得到亚组分Fr.D1~Fr.D6。Fr.D3亚组分经反相ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、TLC薄层制备以及制备型HPLC纯化得到化合物2(2.0 mg)，3(103.3 mg)，5(6.0 mg)，7(5.5 mg)，10(8.6 mg)，11(8.9 mg)。Fr.D4亚组分经正相硅胶柱色谱分离，用石油醚-丙酮(5:1~1:5)进行梯度洗脱得到亚组分Fr.D4-1~Fr.D4-5，Fr.D4-1和Fr.D4-2亚组分经反相ODS柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、TLC薄层制备以及制备型HPLC纯化得到化合物4(5.1 mg)，8(7.0 mg)，9(6.6 mg)，14(10.2 mg)，15(9.6 mg)。

3 结构鉴定

化合物1 淡黄色无定形粉末；HR-ESI-MS m/z 435.158 3 -，计算值436.158 3；D25 = 1.3° (c 0.1, MeOH)。红外光谱数据显示出了内酯环(1 743 cm-1)、羟基(3 381 cm-1)及芳环(1 613, 1 512, 1 448 cm-1)等特征吸收信号。结合13C-NMR数据(表1)进一步确定其分子式为C25H24O7，不饱和度为14。1H-NMR谱显示1组ABX偶合质子信号，1组对位偶合质子信号，1个五取代质子信号，2个甲氧基质子信号，3个亚甲基质子信号 ，1个次甲基质子信号 。其中，为1组典型联苄类化合物质子信号。13C-NMR谱给出了25个碳信号，包括18个芳香碳信号(5个连氧)，2个甲氧基信号，3个亚甲基信号，1个次甲基信号，1个羰基碳信号。

在HMBC谱中，甲氧基质子13-OMe (δH 3.82)与C-13 (δC 149.2)、甲氧基质子3'-OMe (δH 3.75)与C-3' (δC 149.5)相关，结合NOESY谱中甲氧基质子13-OMe (δH 3.82) 与H-14 (δH 6.56)、甲氧基质子3'-OMe (δH 3.75) 与H-2' (δH 6.63) 相关，说明13-OMe与C-13相连，3'-OMe与C-3'相连；在HMBC谱中，H-2 (δH 6.78) 与C-7 (δC 37.7) 相关，结合1H-NMR谱显示的1组对位偶合质子信号 以及COSY谱中H-2 (δH 6.78)与H-3 (δH 6.64)、H-5 (δH 6.64)与H-6 (δH 6.78)相关，说明C-7连有1个对位取代苯环；在HMBC谱中，H-8 (δH 2.69)与C-10 (δC 118.5)、H-14 (δH 6.56)与C-8 (δC 35.6)相关，结合H-14 (δH 6.56) 为五取代质子说明C-8连有一个五取代苯环；在HMBC谱中，H-7' (δH 4.24) 分别与C-2' (δC 111.8) 和C-6' (δC 120.7) 相关，结合1H-NMR谱显示的1组ABX偶合质子信号以及COSY谱中H-5' (δH 6.70)与H-6' (δH 6.43)相关说明C-7'连有1个1,3,4-三取代苯环；在HMBC谱中，H-8'a (δH 2.89)与C-10 (δC 118.5)、H-8'b (δH 2.79) 与C-10 (δC 118.5)、H-7' (δH 4.24)分别与C-9' (δC 169.8)和C-11 (δC 140.3)相关，结合1H和13C-NMR等数据说明C-7'、C-8'、C-9'、C-10和C-11构成1个内酯六元环。

将化合物1的1H和13C-NMR数据与文献报道的化合物gnetumontanin C的1H和13C-NMR数据比较发现，二者区别在于化合物1的取代基位置不同以及C-7双键的存在。比对发现化合物1与化合物vittarin F的基本骨架相似，vittarin F的部分1H-NMR数据(按本文的命名顺序)为，与化合物1相同位置氢的1H-NMR数据相似；vittarin F的部分13C-NMR数据(按本文的命名顺序)为，与化合物1相同位置碳的13C-NMR数据相似，综上所述，确定了化合物1的结构 (图1)，命名为dendrocandin X。

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